微生物裂解方法(哪些方法可以裂解大腸桿菌)
1.哪些方法可以裂解大腸桿菌
裂解細菌的方法和裂解細胞的方法是很相似的，下面是裂解細胞的方法：細胞的破碎方法 1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度.此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等.2.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織.3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時間以及超聲間歇時間、超聲時間可以自己調(diào)整，超聲完全了菌液應(yīng)該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察.對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用.4.反復(fù)凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎.5.化學(xué)處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml.無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應(yīng)該在破碎的同時多加幾次；另外，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取.^__^。
2.微生物分離方法
微生物分離法是獲得微生物純培養(yǎng)物的一種分離方法。通過這個方法可實現(xiàn)一種微生物的培養(yǎng)，或獲得一個細胞的后代。其具體方法有：
1、稀釋倒平皿法。將待分離的材料作一系列稀釋，取不同稀釋度適量涂布于固體培養(yǎng)基平板上或與已熔化的固體培養(yǎng)基一起傾注入平板內(nèi)，經(jīng)過培養(yǎng)即有一個微生物細胞繁殖來的單個菌落。
2、劃線法。先將已熔化的固體培養(yǎng)基制成平板，待凝后，取分離材料在上面劃線，可作平行劃線、扇形劃線或其他形狀的連續(xù)劃線，使菌樣逐漸減少，最后得到單個孤立的菌落。
擴展資料：
微生物分離技術(shù)的應(yīng)用措施：
1、減少毒性氧物質(zhì)的毒害作用：由于常規(guī)培養(yǎng)方法使用的高濃度營養(yǎng)基質(zhì)不利于微生物生長，適當降低營養(yǎng)基質(zhì)的濃度可以減弱這種不利影響。發(fā)現(xiàn)低濃度基質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細菌在數(shù)量和種類上均多于高濃度基質(zhì)的培養(yǎng)基，但營養(yǎng)濃度過低時會使培養(yǎng)出的微生物數(shù)量反而下降。
2、維持微生物間的相互作用：在培養(yǎng)基中加入微生物相互作用的信號分子就可簡單模擬微生物間的相互作用，滿足微生物生長繁殖的要求。
3、供應(yīng)新型的電子供體和受體：不同微生物的代謝過程不同，因此對反應(yīng)的底物要求也不盡相同。供應(yīng)微生物需要的特有底物有助于新陳代謝反應(yīng)的進行及微生物的正常生長。大量的研究表明，將新穎的電子供體和受體應(yīng)用到微生物培養(yǎng)中，能夠發(fā)現(xiàn)未知的生理型微生物。
4、分散微生物細胞：自然界中很多微生物聚集生長，形成“絮體”和“顆?！钡?，致使其內(nèi)部的微生物不易被培養(yǎng)。對“絮體”和“顆?！边M行適度的超聲處理，將細胞分散再進行培養(yǎng)，可以使更多的微生物接觸培養(yǎng)基而得到培養(yǎng)。
5、延長培養(yǎng)時間：對“寡營養(yǎng)菌”的培養(yǎng)，可適當延長培養(yǎng)時間，使其能長至肉眼可見的尺度。當然培養(yǎng)時間不能無限增長，因為培養(yǎng)時間越長，對培養(yǎng)環(huán)境的無菌要求就越高 [4] 。
6、利用瓊脂替代物：瓊脂對某些微生物具有毒性作用，采用無害且凝結(jié)作用較好的替代物質(zhì)作為培養(yǎng)基固化劑，可以增加微生物的可培養(yǎng)性。
參考資料來源：百度百科——微生物分離法
3.分離純化微生物的方法有哪些
主要有
1、稀釋倒平板法
首先把微生物懸液作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分別取不同稀釋液少許，來與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個菌落，自這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。
2.、稀釋涂布平板法
將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴知加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落。
3、平板劃線法
將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離。
4、稀釋搖管法
先將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和道空氣隔開。
4.自然條件下原核微生物基因重組的方式有哪些類型
原核微生物的基因重組 （一）轉(zhuǎn)化 （transformation） 轉(zhuǎn)化是細菌中最早被發(fā)現(xiàn)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移形式。
l928 年 Griffith 用肺炎鏈球菌對小鼠的感染實驗以及 10 多年后 Avery 等體外轉(zhuǎn)化過程的實現(xiàn)，轉(zhuǎn)化因子 DNA 的證實，是現(xiàn)代生命科學(xué)發(fā)展的重要起點。 1 .幾個概念 轉(zhuǎn)化 受體菌直接吸收了來自供體菌的 DNA 片段，通過交換把它整合到自己的基因組中，從而獲得了新的遺傳特性的現(xiàn)象。
轉(zhuǎn)化子（ transformant ） 受體細胞經(jīng)復(fù)制分裂后出現(xiàn)了供體性狀的子代。 感受態(tài) （competence） 細菌能夠從周圍環(huán)境中吸收 DNA 分子進行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。
（二） 轉(zhuǎn)導(dǎo) （transduction） 1952 年 Zinder 和 Lederberg 在驗證鼠傷寒沙門氏菌是否也存在接合現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。 通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的 DNA 片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。
獲得新性狀的受體細胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子 （transductant） 。攜帶供體部分遺傳物質(zhì) （DNA 片段 ） 的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。
在噬菌體內(nèi)僅含有供體菌 DNA 的稱為完全缺陷噬茵體；在噬菌體內(nèi)同時含有供體 DNA 和噬菌體 DNA 的稱為部分缺陷噬菌體 （ 部分噬菌體 DNA 被供體 DNA 所替換 ） 。根據(jù)噬菌體和轉(zhuǎn)導(dǎo) DNA 產(chǎn)生途徑的不同，可將轉(zhuǎn)導(dǎo)分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。
1 .普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) （general transduction） 通過完全缺陷噬菌體對供體菌任何 DNA 小片斷的“誤包”，而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制——“包裹選擇模型”，當噬菌體侵染敏感細菌并在細菌內(nèi)大量復(fù)制增殖時，亦把寄主 DNA 降解為許多小的片段，在裝配時，少數(shù)噬菌體 （10 -6 一 10 -8 ） 錯誤地包裝了宿主的 DNA 片段并能形成“噬菌體”，這種噬菌體稱普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 （ 為完全缺陷噬菌體 ） 。
隨著細菌的裂解，轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體也被大量釋放。當這些轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體再次侵染受體菌時，其中的供體 DNA 片段被注入受體菌。
如果該 DNA 片段能與受體菌 DNA 同源區(qū)段配對，通過遺傳物質(zhì)的雙交換而進行基因重組并形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，稱完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。如鼠傷寒沙門氏菌的 P22 噬菌體、大腸桿菌的 P1 噬菌體和枯草芽孢桿菌的 PBS1 和 SP10 等噬菌體中都能進行完全轉(zhuǎn)導(dǎo)。
如果該 DNA 片斷不能與受體菌 DNA 進行交換、整合和復(fù)制，只以游離和穩(wěn)定的狀態(tài)存在，而僅進行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達，稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)異。發(fā)生流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在其進行分裂后，只能將這段外源 DNA 分配給一個子細胞，而另一子細胞僅獲得供體基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯而形成的少量產(chǎn)物 -- 酶，因此在表型上仍可出現(xiàn)輕微的供體菌特征，每經(jīng)分裂一次，就受到一次“稀釋”。
所以能在選擇培養(yǎng)基上形成微小菌落就成了流成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的特點。 2 .局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) （specialized transduction） 通過部分缺陷噬的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象）。
轉(zhuǎn)導(dǎo)后獲得了供體部分遺傳特性的重組受體細胞稱為局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 （1） 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制——“雜種形成模型” λ噬菌體的線狀雙鏈 DNA 分子的兩端為 12 個核苷酸單鏈（粘性未端 cos 位點），在溶源狀態(tài)下，以前噬菌體狀態(tài)存在于細胞染色體上。
被誘導(dǎo)后，在裂解細菌時，其以粘性末端形成的環(huán)狀分子通過滾環(huán)復(fù)制形成一個含多個基因組的 DNA 多聯(lián)體，以 2 個 cos 位點之間的距離決定其包裝片段的大小而進行切割、包裝，最終形成轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。在極少數(shù)情況下 （ 約 10 -5 ） ，在前噬菌體兩端鄰近位點上與細菌染色體發(fā)生錯誤的切割，使其重新形成的環(huán)狀 DNA 中，同時失去前噬菌體的一部分 DNA 和增加了一段相應(yīng)長度的細菌宿主染色體 DNA ，這樣形成的雜合 DNA 可正常被包裝、復(fù)制。
形成的新轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體稱為部分缺陷噬體。因為λ前噬菌體位點兩端是細菌染色體的 gal + （ 發(fā)酵半乳糖基因 ） 和 bio + （ 利用生物素基因 ） ，故形成的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體通常帶有 gal + 或 bi0 + 基因，故這些部分缺陷噬菌體表示為λ dga1（ 缺陷型半乳糖轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 ） 或λ dbio（ 缺陷性生物素轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 ） 。
這些轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體可重新侵入受體菌，侵入后，噬菌體 DNA 與受體菌的 DNA 同源區(qū)段配對，通過雙交換而整合到受體菌的染色體組上，使受體菌獲得了供體的這部分遺傳特性。 （ 2 ）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)中的低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)與高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) （LFT） ：由于宿主染色體上進行不正常切離的頻率極低，因而在裂解物中所含的部分缺陷噬菌體的比例是極低（ 10 -4 --10 -6 ）的，這種裂解物稱為 LFT 裂解物。
LFT 裂解物在低 m.o.i(multiplicity of infection) 情況下感染宿主，就可獲得極少量的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) （HFT） ：形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率很高，理論上可達 50 %，故稱之為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。
其原因是因為供體菌為雙重溶源菌，它同時有兩種噬菌體整合在細菌的染色體上。例如，大腸桿菌 K12 株，其雙重溶源菌為 E.coli K12（ λ / λ dg）， 即其前噬體體有λ和λ dg 為缺陷噬菌體，帶有供體 gal + 基因，但丟失了部分噬菌體本身的 DNA ；而λ噬菌體為正常噬菌體，不帶 gal 基因，但起輔助作用，稱為輔助噬菌體，可彌補λ dg 的不足，使λ dg 也能。
5.微生物純種分離的方法有哪些
自然界中的微生物總是雜居在一起 即使一粒土或一滴水中也生存著多種微生物 要研究其中某一種微生物 首先必須將它分離出來 下面介紹幾種純種微生物的分離方法
平板劃線分離 將已經(jīng)熔化的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中制成平板 用接種環(huán)沾取少量待分離的材料 在培養(yǎng)基表面平行或分區(qū)劃線（圖5-5）然后 將培養(yǎng)皿放入恒溫箱里培養(yǎng) 在線的開始部分 微生物往往連在一起生長 隨著線的延伸 菌數(shù)逐漸減少 最后可能形成純種的單個菌落
液體稀釋法 將待分離的樣品經(jīng)過大量稀釋后 取稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基表面 培養(yǎng)后就可能得到單個菌落
利用選擇培養(yǎng)基進行分離 不同的微生物對不同的試劑 染料 抗生素等具有不同的抵抗能力 利用這些特點可配制出適合某種微生物生長而限制其他微生物生長的選擇培養(yǎng)基 用這種培養(yǎng)基來培養(yǎng)微生物就可以達到純種分離的目的
菌絲尖端切割 這種方法適于絲狀真菌 用無菌的解剖刀切取位于菌落邊緣的菌絲的尖端 將它們移到合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后 就能得到新菌落
6.微生物計數(shù)方法有哪些
測定微生物計數(shù)的方法有很多，主要有以下幾種：
1.血細胞計數(shù)法
將稀釋的菌液樣品滴在血細胞計數(shù)板上，在顯微鏡下計算4~5個中格的細菌數(shù)，并求出每個小格所含細菌的平均數(shù)，再以此為依據(jù)，估算總菌數(shù).
①此法的缺點是不能區(qū)分死菌和活菌.
②對壓在小方格界線上的細菌，應(yīng)當取平均值計數(shù).
③此法可用于測定培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化
2.稀釋涂布平板法
原理：每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落.培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌.
①這一方法常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目
②統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，原因是當兩個活多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落.因此統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示.
③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數(shù)量均可用此法測定.但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養(yǎng)體等.
④此法若不培養(yǎng)成菌落，可通過將一定量的菌液均勻地涂布在玻片上的一定面積上，經(jīng)固定染色后在顯微鏡下計數(shù)，這樣又稱涂片計數(shù)法.染色可用臺盼藍，臺盼藍能使死細胞染成藍色，可分別計數(shù)死細胞和活細胞.
3.濾膜法
濾膜法是當樣品中菌數(shù)很低時，可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過膜過濾器.然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上（或一定面積上）的細菌數(shù).
此法也可以通過培養(yǎng)觀察形成的菌落數(shù)來推算樣品中的菌數(shù).例如測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目：將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng).在該培養(yǎng)基上大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色，可根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計算出水樣中大腸桿菌的數(shù)目.
此法也是統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目.
4.比濁法
原理是在一定范圍內(nèi)，菌是懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大.因此可借助與分光光度計，在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量.實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確.
5.顯微鏡直接計數(shù)法
在課本生物選修1生物技術(shù)實踐P22中“除了上述活菌計數(shù)法外，顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法.”這里說的顯微鏡直接計數(shù)，我認為應(yīng)該是在稀釋涂布的基礎(chǔ)上不培養(yǎng)成菌落而通過染色的方法在顯微鏡下直接計數(shù).再如濾膜法也一樣，可以有兩種情況.
另外，微生物計數(shù)法發(fā)展迅速，多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法可以用來統(tǒng)計微生物的數(shù)目.
7.微生物分解代謝途徑有哪些
1)EMP途徑：以1分子葡萄糖為底物反應(yīng)產(chǎn)生2分子丙酮酸，2分子NADH+氫離子和2分子ATP。
EMP途徑是絕多數(shù)生物所共有的一條主流代謝途徑。 （2）HMP途徑：是從葡糖-6-磷酸開始的，其特點是葡萄糖不經(jīng)EMP途徑和TCA循環(huán)而得到徹底氧化，并能產(chǎn)生大量還原型煙酸胺腺嘌呤二核苷酸磷酸以及重要中間代謝產(chǎn)物。
在多數(shù)好氧菌和兼性厭氧菌種都存在HMP途徑，而且通常還與EMP途徑同時存在。只有HMP途徑而無EMP途徑的微生物很少，例如弱氧化醋桿菌，氧化葡糖桿菌，氧化醋單胞菌。
（3）ED途徑：以1分子葡萄糖為底物生成2分子丙酮酸，1分子ATP,1分子NADPH和NADH。其特點是只經(jīng)過4步反應(yīng)即可快速獲得由EMP途徑須經(jīng)10步反應(yīng)才能形成的丙酮酸。
ED途徑在革蘭氏陰性菌中分布較廣，特別是假單胞菌和固氮菌的某些菌中較多存在，是缺乏完整EMP途徑的微生物中的一種替代途徑。ED途徑可不依賴于EMP途徑和HMP途徑而單獨存在。
（4）TCA途徑：以1分子丙酮酸為底物，經(jīng)過一系列循環(huán)反應(yīng)而徹底氧化，脫羧形成3分子CO2,4分子NADH2,1分子FADH2和1分子GTP，總共相當于15分子ATP，產(chǎn)能效率極高。這是一個廣泛存在于各生物體中的重要生物化學(xué)反應(yīng)，在各種好氧微生物中普遍存在。
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