石蠟制片(石蠟切片法的詳細過程和注意事項)

1.石蠟切片法的詳細過程 和注意事項

在顯微鏡下觀察植物體內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu)之前，必須根據(jù)植物材料的特性，采用不同的方法，對植物材料進行處理，把材料制成透明的玻片標本.根據(jù)材料的性質(zhì)和制作法的不同，常用的植物顯微制片技術(shù)可以分為切片法與非切片法兩大類，前者常用的有徒手切片法，冰凍切片法，火棉膠切片法，石蠟切片法，冷凍切片法等，其中以石蠟切片法最為常用.后者包括整體封藏法，涂布法，壓片法等.石蠟切片法 石蠟切片法是以石蠟作包埋劑，用旋轉(zhuǎn)切片機將材料切成薄片，經(jīng)一系列處理制成永久制片的方法.在研究植物的細胞，組織，胚胎以及形態(tài)等方面石蠟切片法是最理想的制片方法. 石蠟切片法的一般流程為：取材→固定→抽氣→洗滌→脫水→透明→浸蠟→包埋→修塊→切片→粘片→染色→封片.取材 用鋒利的刀片切取新鮮的植物材料，選定適宜的材料，立即固定.取材的注意事項如下：（1）取材料要新鮮.動作要迅速，以免擠壓損壞組織；取病理材料時，應(yīng)設(shè)置對照材料.（2）所取材料大小要適當：根和莖一般直徑≤5mm，切取成5-10mm小段；葉片一般取過中脈處，切成2-5mm寬，5-8mm長.在切材料時，必須注意刀片與中軸成直角，兩切面平行，否則制成的切片細胞是斜的. 雌，雄蕊一般不需分割.（3）取材時間可根據(jù)切片要求有所區(qū)別.如：在進行植物發(fā)育的研究過程時，需要找到細胞分裂相，一般在晴天的早晨9:00-10:00時取材，此時植物細胞分裂活動較明顯.（4）取材不易過老，否則制片有難度（過老的材料須在滑走切片機上進行）；對縱切的材料適當多取材，如根尖，莖尖等，因為切到材料正中的概率較低.（二）固定 將已切好的材料盡快地浸入相當于材料10-15倍體積的固定液中.借助固定液的作用，使細胞的新陳代謝瞬時停止，并保持細胞或組織的形態(tài)構(gòu)造及其內(nèi)含物的狀態(tài)不發(fā)生變化.從而達到使組織變硬從而便于切片，增強內(nèi)含物的折光度，令細胞易于著色的目的，同時具有防腐作用.以新鮮配制固定液效果較好.固定的時間依材料的種類，性質(zhì)，大小等而定.材料固定完畢，保存于加蓋的容器內(nèi)，貼上標簽.良好的固定劑，應(yīng)是穿透力強，使細胞立刻致死，原生質(zhì)全部凝固；不發(fā)生任何變形，增強折光率，并且不妨礙染色. 常用固定液：簡單固定液 以一種化學(xué)藥品配制的固定液.⑴ 乙醇 為凝固型固定劑.常用無水乙醇或95%乙醇.⑵ 甲醛 為非凝固性固定劑.具強烈刺激性氣味.純凈的甲醛為無色透明液體.固定用的濃度為4%-10%.⑶ 醋酸 為凝固型固定劑.為無色透明的液體，刺激性極強，低溫下凝結(jié)成冰，故又名冰醋酸.2. 混合固定液：由幾種試劑，適量配制而成.混合遵循原則：① 優(yōu)缺點互補；② 膨脹與收縮相互平衡；③ 強氧化劑與還原劑應(yīng)分別配置.常用混合固定液有下列幾種：⑴ FAA 固定液（福爾馬林-冰醋酸-乙醇） 廣泛適用于根，莖，葉，花藥，子房的組織切片，所以又稱為萬能固定液.一般固定時間不低于24 h.該固定液優(yōu)點是在較低溫度下（10℃左右）適用于材料的長期保存，可兼作保存液.并且固定的材料，不妨礙染色，但用于細胞學(xué)上的固定效果較差.⑵ 納瓦興（Navaschjn's）固定液 1912年首創(chuàng).適用于細胞學(xué)與組織學(xué)研究的切片觀察.但滲透慢，不能長期保存；主要用于顯示分裂相.（三）抽氣 植物材料內(nèi)部多由于含有空氣，導(dǎo)致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽氣.以便讓固定液有效透入材料組織中，并排除材料內(nèi)氣泡的干擾.一般抽氣時間為20-30 min.抽過氣的材料在停止抽氣，應(yīng)沉入底部.（四）洗滌 固定液中的成分有可能會妨礙染色或發(fā)生沉淀或結(jié)晶，影響觀察；有的還會繼續(xù)作用，使材料變質(zhì)等.因此，在使用材料時，需根據(jù)固定液的種類，用水，緩沖液或70%乙醇洗去滲入細胞內(nèi)部的固定液.如：用FAA固定的材料在脫水時用70%乙醇反復(fù)洗滌數(shù)次.如用水洗滌，可將材料自固定液中取出，放入指形管，加入半管水，用紗布將管口扎緊，置于水槽內(nèi)，進行流水沖洗.流水沖洗時間一般為12-24 h. （五）脫水 材料經(jīng)洗滌后含有部分水分，會使材料分解.而且透明劑與水是不相混合的，不利于材料的透明和包埋等后期處理.因此需用脫水劑逐漸除去材料中的水分，以便讓石蠟滲透進細胞.所以，脫水是制片的關(guān)鍵環(huán)節(jié).脫水劑要求能與水混合，而且能與其他有機溶劑互相替代.脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進行，防止吸收空氣中的水分；在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料，以免損壞材料.（六）透明 透明劑要具有既能與脫水劑相混合又能和石蠟相混合的性質(zhì)，可以將材料中的脫水劑置換出來，使石蠟?zāi)茼樌M入材料中.二甲苯是目前應(yīng)用最廣的透明劑，作用迅速，但易使材料變脆..（七）浸蠟 是指逐步清除材料中的透明劑，以使石蠟充分滲透于材料內(nèi)部的過程.這樣，材料的各部分都能保持原來的結(jié)構(gòu)與位置，切片不致發(fā)生破裂或其他變形.浸蠟是一個漸進的過程，常用的正丁醇.每次浸蠟的時間，視材料大小而調(diào)節(jié).（八）包埋 材料經(jīng)過足夠時間的浸蠟后，需包入蠟塊，以備切片.操作方法：根據(jù)切片材料大小，確定所需紙盒的尺寸，用表面光滑的磅紙預(yù)先疊好紙盒.（九）切片 即將包埋好的材料塊用切片機切成所需厚度的切片帶.（十）貼片 是。

2.做石蠟包埋切片的流程有哪些,需要注意什么呢

過程大致如下： ⑴固定：生物標本脫離機體或培養(yǎng)環(huán)境，細胞會發(fā)生自溶，腐敗分解。

因此，需用固定劑處理，使蛋白質(zhì)凝固停止瀕死或死后變化。凡供永久保存的標本都需經(jīng)固定處理。

常用的固定劑是甲醛、乙醇等，能使蛋白質(zhì)凝固。還有由幾種試劑配成的固定液，例如Carnoy固定液，由無水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更強，不含水分，可避免水溶性物質(zhì)如糖原等在固定過程中損失。

⑵脫水：是將組織細胞所含水分除去。通常用乙醇（Alcohol，酒精），濃度遞升到 100%。

此過程還使組織塊進一步硬化。 ⑶透明：是用既能溶于純酒精又能融解石蠟的有機溶劑，將組織中的酒精取代，以便石蠟浸入。

通常用二甲苯（xylene）為透明劑。 ⑷浸蠟：在溫箱內(nèi)進行。

已透明的組織塊放入加熱融解的石蠟中，讓石蠟浸透組織，作為支持介質(zhì)。 ⑸包埋：將已浸蠟的組織塊放入熱融的包埋石蠟中，迅速冷凝，組織決便被蠟包埋。

⑹切片：用切片機。常用的切片機有輪轉(zhuǎn)式、平推式的。

用輪轉(zhuǎn)式的易于切出連續(xù)切片。切片厚度隨制片目的而調(diào)整。

教學(xué)標本厚度多是5~6μm。 ⑺貼片烤干：石蠟切片在溫水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色處理。

染色后用樹膠、蓋坡片封固，可永久保存。

3.石蠟治療有什么注意事項?

石蠟治療的注意事項如下：（1）石蠟治療前使治療區(qū)的皮膚保持清潔，如有污穢、汗液應(yīng)除去，毛發(fā)較多時可剃去，有毛發(fā)處應(yīng)涂凡士林。

（2）醫(yī)用蠟中不應(yīng)含有水分，以免引起燙傷。若在加熱熔化時出現(xiàn)啪啪聲和泡沫，則表示有水分。

脫水的方法是將蠟加熱至100?ll0°C，同時不斷攪拌，泡沫及啪啪聲即消失。 （3）石蠟加熱必須采用隔水加熱的方法，以免燒焦或燃燒。

注意防火、防燒、燙傷。蠟療過程中防止發(fā)生燙傷。

為防止燙傷，應(yīng)注意在使用相應(yīng)蠟型時不能用力擠壓，防止中間未凝固的蠟液流出燙傷皮膚；應(yīng)準確掌握蠟溫，同時根據(jù)患者對溫度耐受的個體差異而調(diào)節(jié)蠟溫，不能強求溫度一致，隨時聽取患者的主訴，感覺太熱時應(yīng)即松開外面固定的繃帶，待患者能耐受時再重新固定；所用石蠟中應(yīng)不含有水分；若皮膚上有破損，可在上面蓋一層凡士林紗布后再進行蠟療。 （4）其次，為保證蠟療的療效，制作的相應(yīng)蠟型應(yīng)超過所敷患處的范圍，且讓制作的相應(yīng)蠟型與患處盡量緊貼，塑好形，不留空隙，這樣易于保溫。

4.病理學(xué)檢驗技術(shù)做快速切片的方法和注意事項?

冰凍切片 是免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。

其最突出的優(yōu)點是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細胞表面抗原更應(yīng) 采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。

冰凍時，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。 一般認為冰晶少而大時，影響較小，冰晶小而多時，對組織結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。

冰晶的大小與其生長速率成正比，而與成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴重。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量。

Fish認為冰凍開始時，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C， 從-30。

C降至-43。C之間，成核率急劇增加達1018，然后再減慢。

基于上述理論可采取以下措施減少冰晶的形成。 （1）速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。

C43。C的時間，減少冰晶的形成。

其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精）法：將150-200ml丙酮（酒精）裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時，溫度可達-70℃C，用一小燒杯（50-100ml）內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮（純酒精）飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達-70℃時即可使用。 將組織（大小為1cm*0。

8cm*0。5cm）投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存。

②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當盒底部接觸液氮時 即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。 取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機冰凍切片。

（2）將組織置于20%-30%蔗糖溶液1~3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。 影響冰凍切片的因素較多，因此，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。

目前冰凍切片機有兩類： ①恒慢冰凍切片機（Cryastat）：為較理想的冰凍切片機，型號很多，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機置于-30℃C低溫密閉室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4μm，完全能滿足免疫組織化學(xué)標記要求。 切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃~18℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。

②開放式冰凍切片機：包括半導(dǎo)體致冷切片機和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機。切片時暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術(shù)難度 大，在高溫季節(jié) ，切片更加困難，且切片厚8~15μm，不易連續(xù)切片，但其優(yōu)點是價廉，國內(nèi)有生產(chǎn)。

冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內(nèi)， 或進行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存 石蠟切片 其優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準確。 用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水、透明等過程應(yīng)在4℃。

C下進行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應(yīng)限于2cm*1。

5cm*0。2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。

③浸蠟、包埋過程中，石蠟應(yīng)保持在60℃以下，以溶點低的軟蠟最好（即低溫石蠟包埋）。 以上全過程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動脫水機代替。

如組織塊小， 直徑小于0。5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過程只需4h左右。

石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片機多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2~7μm，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。 由于甲醛固定、有機熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。

有人報告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應(yīng)入37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。

切片如需長期貯存，可存放于4℃冰箱內(nèi)備用。 石蠟切片優(yōu)點較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法（Freeze drying embedding methed），可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。

該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機（Freezing dryer）在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標記、免疫酶標記及放射自顯影。

振動切片 用振動切片機（Vibratotme），可以把新鮮組織（不固定不冰凍）切成厚片20~100μm，以漂浮法在反應(yīng)板進行免疫組織化學(xué)染色，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應(yīng)陽性部位，修整組織進行后固定，最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀察等。 組織不冰凍，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細胞膜抗原，主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布研究。

這種包埋前染色，尤其實用于免疫電鏡觀察。 塑料切片 塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類（Glycol 。

5.固體石蠟如何分等級

石蠟是石油加工產(chǎn)品的一種。

固體烷烴的混合物。無臭無味、白色或淡黃色固體。

由天然石油和人造的含蠟餾分用冷榨或溶劑脫蠟、發(fā)汗等方法制得。用于制高級脂肪酸、高級醇、火柴、蠟燭、防水劑、軟膏、電絕緣材料等。

[1] 石蠟[2]是礦物蠟的一種，也是石油蠟的一種；它是從原油蒸餾所得的潤滑油餾分經(jīng)溶劑精制、溶劑脫蠟或經(jīng)蠟冷凍結(jié)晶、壓榨脫蠟制得蠟膏，再經(jīng)溶劑脫油、精制而得的片狀或針狀結(jié)晶。又稱晶形蠟，碳原子數(shù)約為18~ 30的烴類混合物，主要組分為直鏈烷烴（約為80%~95%），還有少量帶個別支鏈的烷烴和帶長側(cè)鏈的單環(huán)環(huán)烷烴（兩者合計含量20%以下）。

主要質(zhì)量指標為熔點和含油量，前者表示耐溫能力，后者表示純度。其中以前二者用途較廣，主要用作食品及其他商品（如蠟紙、蠟筆、蠟燭、復(fù)寫紙）的組分及包裝材料，烘烤容器的涂敷料、化妝品原料，用于水果保鮮、提高橡膠抗老化性和增加柔韌性、電器元件絕緣、精密鑄造等方面，也可用于氧化生成合成脂肪酸。

注：石蠟是非晶體！ 2化學(xué)性質(zhì)編輯 化學(xué)中，石蠟是固態(tài)高級烷烴混合物的俗名，分子式為CnH2n+2，其中n=20-40。石蠟不與常見的化學(xué)試劑反應(yīng)，但可以燃燒。

3物理性質(zhì)編輯 石蠟又稱晶形蠟，通常是白色、無色無味的蠟狀固體，在47°C-64°C熔化，密度約0.9g/cm3。它不溶于水，但可溶于醚、苯和某些酯中。

純石蠟是很好的絕緣體，其電阻率為1013-1017歐姆·米[2]，比除某些塑料（尤其是特富龍）外的大多數(shù)材料都要高。石蠟也是很好的儲熱材料，其比熱容為2.14–2.9J·g–1·K–1，熔化熱為200–220J·g–1。

石蠟是蠟燭的主要成分。 4元素符號編輯 關(guān)于石蠟的化學(xué)元素符號有幾種說法，一種說法是石蠟的的主要成分是C（碳）、H（氫）兩種元素的物質(zhì)混合而成。

（可能含有氧元素，但這不主要）其化學(xué)元素符號為CxHy。另種說法是石蠟是幾種高級烷烴的混合物，主要是正二十二烷（C22H46）和正二十八烷（C28H58），含碳元素約85%，含氫元素約14%.沒有單一的化學(xué)元素符號。

5性能指標編輯 石蠟的主要性能指標是熔點、含油量和安定性。[3] 熔點 石 蠟是烴類的混合物，因此它并不像純化合物那樣具有嚴格的熔點。

所謂石蠟的熔點、是指在規(guī)定的條件下，冷卻熔化了的石蠟試樣，當冷卻曲線上第一次出現(xiàn)停滯期 的溫度。各種蠟制品都對石蠟要求有良好的耐溫性能，即在特定溫度r.不熔化或軟化變形。

按照使用條件、使用的地區(qū)和季節(jié)以及使用環(huán)境的差異，要求商品石蠟 具有一系列不同的熔點。 影響石蠟熔點的主要因素是所選用原料餾分的輕重，從較重餾分脫出的石蠟的熔點較高。

此外，含油量對石蠟的熔點也有很大的影響，石蠟中含油越多，則其熔點就越低。 含油量 含油量是指石蠟中所含低熔點烴類的量。

含油量過高會影響石蠟的色度和儲存的安定性，還會使它的硬度降低。所以從減壓餾分中脫出的含油蠟膏，還需用發(fā)汗法或溶劑法進行脫油，以降低其含油量。

但大部分石蠟制品中需要含有少量的油，這對改善制品的光澤和脫模性能是有利的。 安定性 石蠟制品在造型或涂敷過程中，長期處于熱熔狀態(tài)，并與空氣接觸，假如安定性不好，就容易氧化變質(zhì)、顏色變深，甚至發(fā)出臭味。

此外，使用時處于光照條件下石蠟也會變黃。因此，要求石蠟具有良好的熱安定性、氧化安定性和光安定性。

影響石蠟安定性的上要因素是其所含有的微量的非烴化合物和稠環(huán)芳烴。為提高石蠟的安定性，就需要對石蠟進行深度精制，以脫除這些雜質(zhì)。

6石蠟分類編輯 根據(jù)加工精制程度不同，可分為全精煉石蠟、半精煉石蠟和粗石蠟3種。每類蠟又按熔點，一般每隔2℃，分成不同的品種，如52,54,56,58等牌號。

粗石蠟含油量較高，主要用于制造火柴、纖維板、篷帆布等。 石蠟 主要成分為直鏈烷烴，并含有少量的支鏈烷烴。

直鏈烷烴含量從75%到接近100%不等。每一特定的品種大約是由8-15個不同碳數(shù)的烷烴所組成。

石蠟是一種白色團體，溶于汽油、二硫化碳、二甲苯、乙醚、苯、氯仿、四氯化碳、石腦油等一類非極性溶劑，不溶于如水和甲醇等極性溶劑。 微晶石蠟 微晶石蠟主要是出文鏈烴、環(huán)烷烴和一些直鏈烴組成，分子量范圍大約是500-1000。

這是一種比較細小的晶體，溶于非極性溶劑，不溶于極性格劑。 液體石蠟 液體石蠟的種類很多，其潤滑效果也各不相同。

在擠出加工中初期潤滑效果良好，熱穩(wěn)定性也較好。但因相溶性差，用量過多時制品易發(fā)粘。

聚乙烯蠟 （簡稱ACPE） 聚乙烯蠟指分子量為1500-25000的低分子量聚乙烯或部分氧化的低分子量聚乙烯。其呈顆粒狀、白色粉末、塊狀以及乳白色蠟狀。

具有優(yōu)良的流動性、電性能、脫模性。 半精煉石蠟 為顆粒狀白色固體.其相對密度隨熔點的上升而增加.產(chǎn)品化學(xué)穩(wěn)定性好，含油量適中，具有良好的防潮和絕緣性能，可塑性好.半精煉石蠟生產(chǎn)的蠟燭火焰集中，無煙，不流淚. 用于蠟燭，蠟筆，蠟紙，一般電訊器材以及短路及輕工，化工原料。

7切片制作編輯 石 蠟切片以石蠟制作的切片，可以制成極薄的切片。一般的切片厚度要求在4—6微米。

而石蠟切片不但可以達到這個要求，甚至可以切得更薄到2微米以。