目視比色法(比色法操作的注意事項是什么?)
1.比色法操作的注意事項是什么?
噻唑藍(lán)（MTT）比色法操作注意事項
噻唑藍(lán)（MTT）：四唑鹽
1. 原理：
MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法.活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)成正比。
2. 優(yōu)點(diǎn)：簡單快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)
3. 缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對實(shí)驗者也有損害。
4. 應(yīng)用：新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實(shí)驗等
5. MTT主要有兩個用途
1）藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定；
2） 細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。
6. 比色法操作注意事項
1） 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度，保證細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時濃度不至于過滿。
2） 種板技術(shù)：均勻。
3） 實(shí)驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，溶媒孔，加藥孔。
調(diào)零孔：培養(yǎng)基、MTT、DMSO。（無細(xì)胞）
溶媒孔：培養(yǎng)液、MTT、DMSO、細(xì)胞、溶酶。
加藥孔：培養(yǎng)液、MTT、DMSO、細(xì)胞、不同濃度的藥物。
（一般5-7個梯度，設(shè)3-5個復(fù)孔）
4）避免血清干擾：一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。
5）邊緣效應(yīng)：周邊孔加入PBS。
6)MTT的配置： MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液。4℃下避光保存2周。
7）孔板的重復(fù)利用（1.做完MTT后用大水流盡量將板沖凈，然后用洗衣粉水泡幾個小時（小心最好讓洗衣粉先化開）。2.用自來水沖凈洗衣粉水，倒扣晾
干.3.重鉻酸鉀加濃硫酸配成的酸液中浸泡過夜泡洗液（六小時以上即可）后自來水洗凈（20次左右）每個孔都要處理4.用去離子水沖洗3遍，雙蒸水沖洗3
遍，烤干5.超凈臺中紫外線照射2個小時左右，就可以用了，不可以高壓?；蚺菟徇^夜，dd水沖洗干凈，烘干或者晾干后紫外照射30min以上即可使用。
8)MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。
9）在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實(shí)驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。
10)MTT有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套。
11）配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以操作臺上的照明燈關(guān)掉。
2.目視比濁法
方法提要
濁度與透視度呈反比關(guān)系，水樣與標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行透視度比測，定值。本方法規(guī)定1000mL純水中含高嶺土1mg的濁度為1°。
本法適用于近海海域和大洋水濁度的測定。3個實(shí)驗室分析了用無濁純水配制水樣，濃度分別為7.0mg/L和50.0mg/L，測試結(jié)果重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.78%，相對誤差為4.10%。
試劑
無濁純水取蒸餾水或去離子水，通過0.2μm濾膜抽濾，貯存于聚乙烯桶中，用過濾水淋洗聚乙烯桶2次，棄去初濾水200mL，最好當(dāng)天制備。
濾膜（0.2μm）。
二氯化汞溶液（50g/L）（注意：二氯化汞劇毒，小心操作?。?。
焦磷酸鈉溶液（50g/L）。
高嶺土（機(jī)選特號）。
濁度標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液將高嶺土置于（105±1）℃烘箱中烘干2h，移入盛有硅膠的干燥器中，冷卻30min。稱取3~5g高嶺土，置于瑪瑙研缽中加少量水調(diào)成稀糊狀，研磨約50min，全部轉(zhuǎn)移入1000mL量筒中，補(bǔ)加純水到1000mL標(biāo)線處，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，在?0±0.5）℃下靜置24h。用虹吸法吸取上層800mL懸濁液移入第2個1000mL量筒中，補(bǔ)加無濁純水到1000mL標(biāo)線處，充分?jǐn)噭蚝?，再次置于?0±0.5）℃下靜放24h。用虹吸法吸除上層液800mL，留取底層200mL懸濁液并加純水到1000mL標(biāo)線，然后盛于1000mL棕色試劑瓶中，塞嚴(yán)保存。
濁度標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液濁度的標(biāo)定量取50.0mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于恒量（m1）的蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上蒸干，移于105℃干燥箱中烘2h。置于硅膠干燥器中冷卻30min，稱量（m2）。重復(fù)烘干、冷卻、稱量步驟，直到兩次質(zhì)量差小于0.2mg。按下式計算濁度標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液中高嶺土的質(zhì)量濃度：
巖石礦物分析第四分冊資源與環(huán)境調(diào)查分析技術(shù)
式中：ρ高嶺土為濁度標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液中高嶺土的質(zhì)量濃度，mg/mL;V為量取濁度標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的體積，50.0mL;m1為蒸發(fā)皿的質(zhì)量，g;m2為蒸發(fā)皿加烘干后高嶺土的質(zhì)量，g。
此濁度標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液濁度=ρ高嶺土*1000。
濁度標(biāo)準(zhǔn)中間溶液準(zhǔn)確量取一定體積含有250mg高嶺土的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液置于1000mL容量瓶中，加入1.0g二氯化汞（HgCl2）；溶解后，補(bǔ)加無濁純水至標(biāo)線，充分混勻，轉(zhuǎn)入具橡皮塞的棕色試劑瓶中。此標(biāo)準(zhǔn)中間溶液濃度為0.25mg/mL。濁度為250°。
濁度標(biāo)準(zhǔn)溶液移取40.0mL濁度標(biāo)準(zhǔn)中間溶液置于100mL容量瓶中，加入0.50mL焦磷酸鈉溶液，加無濁純水至標(biāo)線，混勻。此液濁度為100°。
校準(zhǔn)曲線取12支100mL具塞比色管，分別加入0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL、8.00mL、9.00mL、10.0mL濁度標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入50.0mL二氯化汞溶液，然后再加無濁純水至標(biāo)線，混勻。此系列濁度分別為0°、0.50°、1.00°、2.00°、3.00°、4.00°、5.00°、6.00°、7.00°、8.00°、9.00°、10.0°。
分析步驟
將混勻的水樣，傾入具塞比色管中至標(biāo)線，立即同標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。水樣濁度為0°~10°范圍的測定，用黑色背景，垂直目視比較而定；10°以上的測定用黃色方格坐標(biāo)紙為背景，水平透視方格線條的清晰程度而定量。然后將測定值記入渾濁度記錄表，取兩位有效讀數(shù)；若水樣濁度超過100°，則需用無濁純水稀釋水樣至可測范圍，將測定值乘以稀釋倍數(shù)，即為原水樣濁度。
注意事項
1）每次量取水樣或標(biāo)準(zhǔn)液時，必須將水樣瓶橫放，上下強(qiáng)烈振蕩30次后，立即取出水樣。
2）玻璃試劑瓶磨口與磨口塞之間，在啟瓶對磨中，可增大所盛液體的濁度。因此所用水樣瓶及試劑瓶，均應(yīng)配換橡膠塞，并將膠塞置于盛純水的燒杯中煮沸2h。
3）水樣中具有迅速下沉的碎屑及粗大沉淀物都可被測定為濁度。不潔凈的玻璃器皿和空氣泡，以及擾亂水樣表面能見度的振動都能造成虛假結(jié)果。
4）水樣保存，在取樣當(dāng)天測定濁度。如果不可避免要保持更長時間，將水樣保存暗處可達(dá)24h。如若在樣品中加HgCl2固定劑，可保存22d。
5）除非另作說明，本法中所用試劑均為分析純，水為無濁水或等效純水。
3.比色法操作的注意事項是什么?
1選擇合適的熔樣方法，制備合適的試樣溶液（1）氫氧化鈉為熔劑，鹽酸分解；（2）碳酸鈉燒結(jié)，鹽酸分解或碳酸鈉燒結(jié)，氯化銨重量法測定純SiO。
時的濾液，以及純SiO。殘渣經(jīng)焦硫酸鉀熔融后分解溶液，二者合并；（3）碳酸鈉一硼砂為混合熔劑，稀硝酸和稀硫酸溶解后之濾液，或者稀硝酸溶解液，或濃鹽酸分解。
2顯色反應(yīng)（1）掩蔽劑與顯色劑應(yīng)有正確的配制和保存方法，否則影響吸光度。（2）顯色溫度與時間。
顯色反應(yīng)有一定的溫度和時間要求，如高碘酸鉀氧化比色法分析MnO，應(yīng)微沸10~15min使顯色完全，并冷卻至室溫下比色。二安替比林甲烷比色法分析TiO。
由于顯色反應(yīng)較慢，顯色時間則需較長時間（40min以上）。（3）比色。
比色儀器分光光度計應(yīng)定期檢定，應(yīng)選擇正確的波長，合適光程的比色皿。色皿應(yīng)保持干凈，受污染的比色皿可用稀硝酸浸洗，用鏡頭紙擦拭表面，比色皿內(nèi)液體不能有氣泡或懸浮物。
通常情況下，比色測定在室溫進(jìn)行。
4.什么叫比色法?操作上應(yīng)該注意什么問題?
定義 以生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。
比色法作為一種定量分析的方法，開始于19世紀(jì)30~40年代。比色分析對顯色反應(yīng)的基本要求是：反應(yīng)應(yīng)具有較高的靈敏度和選擇性，反應(yīng)生成的有色化合物的組成恒定且較穩(wěn)定，它和顯色劑的顏色差別較大。
選擇適當(dāng)?shù)娘@色反應(yīng)和控制好適宜的反應(yīng)條件，是比色分析的關(guān)鍵。 常用方法 常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，兩種方法都是以朗伯-比爾定律[1](A=εbc)為基礎(chǔ)。
常用的目視比色法是標(biāo)準(zhǔn)系列法，即用不同量的待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液在完全相同的一組比色管中，先按分析步驟顯色，配成顏色逐漸遞變的標(biāo)準(zhǔn)色階。試樣溶液也在完全相同條件下顯色，和標(biāo)準(zhǔn)色階作比較，目視找出色澤最相近的那一份標(biāo)準(zhǔn)，由其中所含標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，計算確定試樣中待測組分的含量。
光電比色法是在光電比色計上測量一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，將吸光度對濃度作圖，繪制工作曲線，然后根據(jù)待測組分溶液的吸光度在工作曲線上查得其濃度或含量。與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀誤差，提高了測量準(zhǔn)確度，而且可以通過選擇濾光片來消除干擾，從而提高了選擇性。
但光電比色計采用鎢燈光源和濾光片，只適用于可見光譜區(qū)和只能 得到一定波長范圍的復(fù)合光 ， 而不是單色光束，還有其他一些局限，使它無論在測量的準(zhǔn)確度、靈敏度和應(yīng)用范圍上都不如紫外-可見分光光度計。20 世紀(jì)30~60年代，是比色法發(fā)展的旺盛時期，此后就逐漸為分光光度法所代替。
比色法在無機(jī)材料分析中的應(yīng)用及注意事項： 1比色法的應(yīng)用比色法是利用溶液顏色的深淺來確定待測物質(zhì)含量的一種方法.在無機(jī)材料低含量成分分析中，與常用的滴定法、重量法比較，比色法具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度.例如，TiO2滴定法，存在操作麻煩、終點(diǎn)顏色難以辨認(rèn)的缺點(diǎn).礬土、普通礦渣、鐵礦石中的TiO2、MnO，粘土、水泥中的TiO2，石灰石中的SiO2、Al2O3、Fe2O3，硅砂中的Fe2O3等等，這些成份含量低，一般在5%以下，若采用滴定法分析，0.05ml的滴定量就造成較大的誤差，甚至未能檢測出結(jié)果.特別是硅質(zhì)玻璃原料硅砂中的Fe2O3，微量Fe2O3直接影響其產(chǎn)品質(zhì)量的評級，因此不能采用滴定法，而應(yīng)采用比色法進(jìn)行分析（見JC/T753-2001硅質(zhì)玻璃原料化學(xué)分析方法）.比色法是無機(jī)材料化學(xué)成分分析的常用方法之一，TiO2、MnO、Al2O3、Fe2O3、SiO2等低含量成份，采用比色法可獲得較高的準(zhǔn)確度，從而能更好地指導(dǎo)生產(chǎn).。
5.目視觀察法注意的事項有哪些
(1)試樣的控制，試樣受檢面必須保持完整，不允許有擦花或劃傷等破壞，而且受檢面必須清潔，不允許有污漬、油污等臟物覆蓋在受檢面上，因此測試前一般要用不破壞氧化膜的有機(jī)溶劑輕輕擦拭試樣表面； （2）試驗溶液濃度的控制，氫氧化鈉溶液的濃度必須嚴(yán)格控制到100g/L，濃度偏低或偏高將直接導(dǎo)致測試結(jié)果偏大或偏小； （3）試驗溫度的控制，試驗時不僅要保證試驗環(huán)境溫度控制在35℃±1℃，而且試驗溶液和試樣也必須控制在35℃±1℃，為此在測試前應(yīng)先將試液和試樣放置于恒溫儀器中保持一段時間，只有當(dāng)試液和試樣恒定在35℃±1℃之后才可以進(jìn)行測試。
6.目視觀察法的注意事項有哪些
對于滴堿試驗考慮的關(guān)鍵是，試驗溫度的控制以及如何準(zhǔn)確地判斷氧化膜剛好被穿透的時間。
我國GB/T5237。2-2000中對滴堿試驗方法規(guī)定為：“在35℃±1℃下，將大約10mg、100g/LNaOH溶液滴至型材試樣的表面，目視觀察液滴處直至產(chǎn)生腐蝕冒泡，計算其氧化膜被穿透的時間。
也可用儀器測量氧化膜穿透的時間。”也就是說，國標(biāo)認(rèn)可了兩種滴堿試驗方法，即目視觀察法和儀器測量法。
對于目試驗觀察法，國標(biāo)描述的比較簡單，試驗操作中的一些注意事項及其影響因素未作描述。而為了保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，在操作過程中對于影響因素應(yīng)加以注意，以便盡可能減少或避免這些因素的影響，本方法應(yīng)注意的事項主要有以下幾點(diǎn)： （1）試樣的控制，試樣受檢面必須保持完整，不允許有擦花或劃傷等破壞，而且受檢面必須清潔，不允許有污漬、油污等臟物覆蓋在受檢面上，因此測試前一般要用不破壞氧化膜的有機(jī)溶劑輕輕擦拭試樣表面； （2）試驗溶液濃度的控制，氫氧化鈉溶液的濃度必須嚴(yán)格控制到100g/L，濃度偏低或偏高將直接導(dǎo)致測試結(jié)果偏大或偏小； （3）試驗溫度的控制，試驗時不僅要保證試驗環(huán)境溫度控制在35℃±1℃，而且試驗溶液和試樣也必須控制在35℃±1℃，為此在測試前應(yīng)先將試液和試樣放置于恒溫儀器中保持一段時間，只有當(dāng)試液和試樣恒定在35℃±1℃之后才可以進(jìn)行測試；其四是恒溫儀器的選用，恒溫儀器的選用在本方法中是一個非常重要的環(huán)節(jié)，因為所選用的恒溫儀器不僅應(yīng)起到恒溫的作用，還必須考慮要便于觀察儀器內(nèi)試樣的變化情況，如果所選用的恒溫儀器沒有一個能夠清晰地觀察儀器內(nèi)試樣變化情況的觀察口，那么要想準(zhǔn)確地判斷出試樣何時開始腐蝕冒泡是不大可能的。
另外，目視觀察法還受試驗人員經(jīng)驗的影響，在實(shí)際檢驗工作中發(fā)現(xiàn)，從陽極氧化膜開始溶解到氧化膜被穿透（試樣開始腐蝕冒泡）這一過程中并沒有一個很明顯的變化，給氧化膜穿透時間的判斷帶來很大難度，這就對試驗人員提出了很高的要求，試驗人員必須要有非常豐富的實(shí)踐經(jīng)驗，能夠準(zhǔn)確地判斷出氧化膜何時被穿透而開始腐蝕冒泡。
7.如何用目視比色法快速測試果園土壤和果樹植株氮磷鉀速效養(yǎng)分
第一步：果園土壤和果樹植物供試液的制備。
土壤中易被作物吸收利用的養(yǎng)分稱為土壤速效養(yǎng)分，這些養(yǎng) 分主要存在于土壤溶液和土壤膠體上，用適當(dāng)?shù)乃?、堿或鹽類的 溶液處理土壤，可將它們?nèi)芙夂痛鷵Q出來i①測定土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和速效鉀供試液的制備（此為供 試液I）。 稱取相當(dāng)于2克干土的濕土，放入干凈的小浸提杯中，用量筒加入0。
5摩爾/升硫酸鈉（Na2S04? 10H2O）溶液10毫 升，蓋好杯子，用力上下?lián)u動300次后，打開杯蓋，將折疊好的7厘米中速濾紙，使尖端向下放入小杯子中，以滲透于濾紙錐形 - 體內(nèi)的清液供測試硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和速效鉀備用。 ②測定土壤速效憐供試液的制備（此為供試液II）。
稱取相 當(dāng)于2克干土的濕土，放入干凈的小浸提杯中，用量筒加人0。5 摩爾/升碳酸氫鈉（NaHC03）浸提劑10毫升，蓋好杯子，振蕩 和滲濾方法同供試液工。
③植物供試液的制備（此為供試液IE）。果樹根系自土壤中 吸收的無機(jī)養(yǎng)分，在果樹根系、枝、葉等組織液中有所積累，用 組織汁液測定它們的含量，可以反應(yīng)土壤養(yǎng)分的供應(yīng)狀況，作為 營養(yǎng)水平的指標(biāo)。
制備植物供試液的方法很多，現(xiàn)介紹用冷水浸 提制備供試液：把處理好的果樹待測部位（一般是葉片或葉柄）取下，用剪 刀剪碎，在1/100托盤天平上稱樣0。5克，放入小浸提杯中，并 用玻璃棒搗碎，然后加蒸餾水10毫升，蓋好杯子紀(jì)振蕩和滲濾 步驟同土壤供試液的制備。
第二步：果園土壤和果樹植株速效氮磷鉀養(yǎng)分的測定。①土壤和植株中硝態(tài)氮（N03— N）的測定3制備標(biāo)準(zhǔn)色階 和供試液中硝態(tài)氮的測定，可同時在比色盤中，按硝態(tài)氮測定表 5 - 5進(jìn)行。
表格里的雙線左上方，為制備比色標(biāo)準(zhǔn)溶液，。
雙線的右上方 為待測試液，只有在標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液都按要求依次制備好 后，才能同時按雙線以下各操作步驟進(jìn)行。
8.目視比色法的缺點(diǎn)
目視比色法的主要缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度不高，如果待測液中存在第二種有色物質(zhì)，甚至?xí)o法進(jìn)行測定。另外，由于許多有色溶液顏色不穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)系列不能久存，經(jīng)常需在測定時配制，比較麻煩。雖然可采用其某些穩(wěn)定的有色物質(zhì) （ 如重鉻酸鉀、硫酸銅和硫酸鈷等 ） 配制永久性標(biāo)準(zhǔn)系列，或利用有色塑料、有色玻璃制成永久色階，但由于它們的顏色與試液的顏色往往有差異，也需要進(jìn)行校正。
9.大家能不能介紹一下比色法
通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法以生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。
比色法作為一種定量分析的方法，開始于19世紀(jì)30~40年代。比色分析對顯色反應(yīng)的基本要求是：反應(yīng)應(yīng)具有較高的靈敏度和選擇性，反應(yīng)生成的有色化合物的組成恒定且較穩(wěn)定，它和顯色劑的顏色差別較大。
選擇適當(dāng)?shù)娘@色反應(yīng)和控制好適宜的反應(yīng)條件，是比色分析的關(guān)鍵。 常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，兩種方法都是以朗伯-比爾定律[1](A=εbc)為基礎(chǔ)。
常用的目視比色法是標(biāo)準(zhǔn)系列法，即用不同量的待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液在完全相同的一組比色管中，先按分析步驟顯色，配成顏色逐漸遞變的標(biāo)準(zhǔn)色階。試樣溶液也在完全相同條件下顯色，和標(biāo)準(zhǔn)色階作比較，目視找出色澤最相近的那一份標(biāo)準(zhǔn)，由其中所含標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，計算確定試樣中待測組分的含量。
光電比色法是在光電比色計上測量一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，將吸光度對濃度作圖，繪制工作曲線，然后根據(jù)待測組分溶液的吸光度在工作曲線上查得其濃度或含量。與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀誤差，提高了測量準(zhǔn)確度，而且可以通過選擇濾光片來消除干擾，從而提高了選擇性。
但光電比色計采用鎢燈光源和濾光片，只適用于可見光譜區(qū)和只能 得到一定波長范圍的復(fù)合光 ， 而不是單色光束，還有其他一些局限，使它無論在測量的準(zhǔn)確度、靈敏度和應(yīng)用范圍上都不如紫外-可見分光光度計。20 世紀(jì)30~60年代，是比色法發(fā)展的旺盛時期，此后就逐漸為分光光度法所代替。
