pcr加樣(PCR加樣有什么需要注意的?)

1.PCR加樣有什么需要注意的?

實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；

2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；

5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；

6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；

7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；

8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。

2.我想問做PCR擴(kuò)增應(yīng)該注意的事項(xiàng)?

注意] 1、整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。

另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會(huì)有蛋白質(zhì)污染，影響比值 2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 總mRNA的提取（自己的經(jīng)驗(yàn)） 一、關(guān)于Trizol Reagent需要的試劑 1. Chloroform：氯仿 （分析純） 2. Isoproplyl alcohol：異丙醇（分析純） 3. 75% Ethanol(in DEPC-treated water):75%乙醇。

要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。 4. RNase-free water：無Rnase的水。

方法是：將DEPC按0.01%(V/V)加在d H2O中500ml(50ul)，在37℃過夜，并高壓滅菌即得（150℃ 3小時(shí)） 5. 一次性塑料手套 6. 注意：DEPC有致癌之嫌 二、關(guān)于Trizol Reagent的使用過程： 1. Homogenization（勻漿） a. Tissues：組織 每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。 b. Cells Grown in monolayer（單層細(xì)胞接毒后出現(xiàn)病變的） 針對JEV細(xì)胞總RNA的抽提法： BHK21細(xì)胞長成單層后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。

出 現(xiàn)75%-100%的病變時(shí)，以PBS（預(yù)冷）沖洗細(xì)胞兩次，直接在細(xì)胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細(xì)胞（細(xì)胞瓶有兩 種常用規(guī)格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細(xì)胞瓶而定，以蓋滿瓶 底為度，而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，否則可導(dǎo)致DNA的污染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮） （1） 組織接入預(yù)冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細(xì)胞，置室溫5min，以使核蛋白復(fù)合物徹底分離。

（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入氯仿0.2ml），蓋好，劇烈震蕩15s，置室溫2-3分鐘。 （3） 4℃離心，10000g*15min，離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。

RNA包含在水相中，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizol試劑量的60%。 (4) 仔細(xì)吸取上層水相，移至另一EP管中。

（5） 加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。 (6) 4℃離心，10000g*10min。

RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。 （7） 棄上清液，加入預(yù)冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震蕩，充分洗滌沉淀，4℃離心，5500g*5min。

棄上清液，空氣干燥（或真空干燥）后，沉淀重懸于無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA,-70℃保存?zhèn)溆谩?（8） 抽提出的細(xì)胞總RNA干燥后加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。

于0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計(jì)下檢測，結(jié)果應(yīng)為：A260/280 ratio。

3.PCR實(shí)驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)

PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

酶切分析： 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內(nèi)部寡核苷酸）標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。 氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。

提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。

RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40 ~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100~300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套； 2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。

若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度； 5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管； 6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性； 7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)； 8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。

4.PCR擴(kuò)增需要注意的點(diǎn)

1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長或過短均會(huì)使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補(bǔ)序列；引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計(jì)時(shí)可在5'末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和/或啟動(dòng)密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過低會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)量，過高會(huì)增加引物二聚或錯(cuò)配的幾率。

2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯(cuò)配無校正功能，發(fā)生堿基錯(cuò)配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗(yàn)活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯(cuò)配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯(cuò)誤率） （數(shù)據(jù)來源：美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室）。

3. Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴(kuò)增。

4. dNTP的濃度過高會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過低則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時(shí)4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯(cuò)配誤差和提高使用效率。

5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長度，通過Tm=4(G+C)+2(A+T) 計(jì)算得到。在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。

6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個(gè)工作區(qū)的獨(dú)立性；③使用陽性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗(yàn)的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲(chǔ)存，每個(gè)包裝僅用于單次實(shí)驗(yàn)；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時(shí)必須戴手套；⑦實(shí)驗(yàn)前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。

5.在PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意什么

PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。

在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。

需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。

有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。

如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 假陽性 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。

需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。

這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。

所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。

二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。

其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。

適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。